Statistical Improvement of rGILCC 1 and rPOXA 1B Laccases Activity Assay Conditions Supported by Molecular Dynamics

Abstract

Las lacasas (E.C. 1.10.3.2) son glicoproteínas ampliamente distribuidas en la naturaleza. Su conformación estructural incluye tres sitios de cobre en su centro catalítico, responsables de facilitar la oxidación del sustrato, generando H₂O en lugar de H₂O₂. Los resultados de la medición de la actividad de lacasa (UL−1) pueden variar según el tipo de lacasa, el tampón, los mediadores redox y los sustratos empleados. El objetivo fue seleccionar las mejores condiciones para el ensayo de la actividad de las lacasas rGILCC 1 y rPOXA 1B. Tras ensayos estadísticos secuenciales, la dinámica molecular demostró respaldar este proceso, y nuestro objetivo fue recopilar información valiosa sobre la posible aplicación de estas enzimas en la degradación de nuevos sustratos con implicaciones ambientales negativas. El tratamiento con tampón citrato T2 (CB T2) (pH 3,0 ± 0,2; λ420 nm, 2 mM ABTS) tuvo los resultados más favorables, con 7,315 ± 0,131 UL−1 para rGILCC 1 y 5291,665 ± 45,83 UL−1 para rPOXA 1B. El uso de tampón citrato aumentó la afinidad enzimática por ABTS, ya que se produjeron valores de Km más bajos para ambas enzimas (1,49 × 10−2 mM para rGILCC 1 y 3,72 × 10−2 mM para rPOXA 1B) en comparación con los obtenidos en tampón acetato (5,36 × 10−2 mM para rGILCC 1 y 1,72 mM para rPOXA 1B). La dinámica molecular de GILCC 1–ABTS y POXA 1B–ABTS mostró un comportamiento estable, con valores de desviación cuadrática media (RMSD) no superiores a 2,0 Å. Las actividades enzimáticas (rGILCC 1 y rPOXA 1B) y las interacciones del modelo 3D con ABTS (GILCC 1–ABTS y POXA 1B–ABTS) se vieron fuertemente influenciadas por el pH, la longitud de onda, los iones y la concentración de ABTS, lo cual se vio respaldado por estudios computacionales que identificaron los residuos estabilizadores y las interacciones. La integración de los enfoques experimentales y computacionales permitió comprender en profundidad las interacciones enzima-sustrato, lo que ofrece posibles aplicaciones en el tratamiento de sustratos ambientales.